Bevorzugte Spaltung des Coronavirus-defekten Virusgenoms durch zelluläre Endoribonuklease mit Eigenschaften von RNase L

Synthese eines RNA-Fragments aus der Spaltung des defekten viralen Genoms 12.7

Bei einem Versuch zu untersuchen, ob das defekte virale Genom (DVG) 12.7 des bovinen Coronavirus (BCoV) mit der Transkriptionsregulierungssequenz (TRS) das von TRS abgeleitete subgenomische DVG 12.7 (sgmDVG 12.7) synthetisieren kann (Abb. 1A), wurde es von Northern unerwartet gefunden Blot-Assay ergab, dass zusätzlich zum vorhergesagten sgmDVG 12.7 ein RNA-Fragment, das kürzer als sgmDVG 12.7 ist, in BCoV-infizierten HRT-18-Zellen identifiziert wurde (in Abb. 1B durch einen roten Pfeil gekennzeichnet). Da (i) sich die Primersonde für den Northern-Blot-Assay im Reportergen befand (Abb. 1A) und (ii) die Größe des RNA-Fragments geringer war als die von sgmDVG 12.7 (Abb. 1B), wurde dies vermutet dass das RNA-Fragment von DVG12.7 stammt.

Um die mögliche Stelle zu bestimmen, von der das RNA-Fragment stammte, wurde RNA, die 1 Stunde nach der Transfektion (hpt) aus DVG12.7-transfizierten BCoV-infizierten HRT-18-Zellen extrahiert wurde, einer schnellen Amplifikation der cDNA-Enden (RACE) und einer anschließenden PCR unterzogen Sequenzierung. Die Sequenzierungsergebnisse legten nahe, dass das in Abb. 1B identifizierte RNA-Fragment ein gespaltenes RNA-Produkt war, das von DVG12.7 stammte (Abb. 1C). Die Spaltstellen befanden sich an den Nukleotidpositionen 1783 und 1784 in DVG12.7 (Abb. 1C). Darüber hinaus befindet sich die Spaltstelle stromabwärts des TRS, in der Schleifenregion von Stamm-Schleife II und nach UU- und UA-Dinukleotiden (Abb. 1D). Somit war das kürzere RNA-Fragment ein gespaltenes RNA-Produkt, das von DVG12.7 abgeleitet war und als gespaltenes DVG (clvDVG) bezeichnet wurde (Abb. 1E).

Bevorzugte Spaltung des Coronavirus-defekten Virusgenoms durch zelluläre Endoribonuklease mit Eigenschaften von RNase L | Virologie-Journal — **Abb. 1**

Die Spaltung von DVG12.7 wird durch zelluläre Endoribonuklease verursacht

Um die zellulären oder viralen Faktoren zu bestimmen, die zur Spaltung führen, wurden nicht infizierte oder BCoV-infizierte HRT-18-Zellen mit DVG12.7 transfiziert und die gesamte zelluläre RNA wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transfektion gesammelt. Wie in Abb. 2 gezeigt, wurde clvDVG bei 0,5 bis 6 hpt in scheininfizierten HRT-Zellen beobachtet (Abb. 2, linkes Feld). In BCoV-infizierten HRT-18-Zellen wurde clvDVG ebenfalls bei 0,5 bis 6 hpt beobachtet, verschwand jedoch allmählich nach 6 hpt (Abb. 2, rechtes Feld). Stattdessen begann die Synthese von sgmDVG12.7 9 Stunden nach der Transfektion (Abb. 2, rechtes Feld). Das gespaltene DVG12.7-Fragment slvDVG wurde sowohl in nicht infizierten als auch in infizierten HRT18-Zellen identifiziert, was darauf hindeutet, dass zelluläre Endoribonuklease für die Spaltung verantwortlich ist. Beachten Sie, dass das Verhältnis von gespaltenem zu ungespaltenem DVG12.7 konstant war (10–15 %) und mit der Zeit nicht anstieg (Abb. 2, unteres Feld). Darüber hinaus wurde vermutet, dass die koronavirale RNA-Synthese in einem modifizierten Kompartiment an der Membran des endoplasmatischen Retikulums stattfinden kann [29]. Dieses modifizierte Kompartiment hat den Vorteil, dass es die virale RNA vor antiviralen Abwehrmechanismen wie dem RNA-Abbau durch zelluläre RNasen schützt [29, 30]. Obwohl also die Mengen an DVG12.7 bei 9 und 24 hpt in infizierten HRT-18-Zellen reichlich vorhanden sind, findet keine Spaltung statt und clvDVG wird nicht synthetisiert, was zu nahezu nicht nachweisbaren clvDVG-Spiegeln bei 9 und 24 hpt in infizierten HRT-18-Zellen führt. 18 Zellen.

Charakterisierung der gespaltenen Merkmale von clvDVG

Es wurde experimentell festgestellt, dass es in der Region, in der sich das TRS befindet, zwei Stammschleifen gibt (Abb. 1D). [14]. Um festzustellen, ob die Sequenz oder Struktur von Stamm-Schleife II, an der sich die Spaltungsstelle befindet, auch einen Einfluss auf die Spaltungseffizienz hat, wurde eine kompensatorische Mutation durchgeführt (Abb. 3A). Wie in Abb. 3B gezeigt, verringerte sich die Spaltungseffizienz, wenn die Strukturen von SL II verändert wurden (DVGSLIIR und DVGSLIIL) oder wenn die Strukturen beibehalten, aber die Sequenzen verändert wurden (DVGSLIIRL), was darauf hindeutet, dass sowohl die Sequenz als auch die Struktur dies können beeinflussen die Spaltungseffizienz von DVG12.7.

Die Korrelation der DVG12.7-Spaltung mit den Eigenschaften von RNase L

Die in Abb. 1C und D gezeigten Ergebnisse zeigten, dass die bevorzugten Spaltstellen in DVG12.7 nach UU- und UA-Dinukleotiden liegen, die sich in der Einzelstrangregion von Stamm-Schleife II befinden. Darüber hinaus stammt der Faktor, der zu dieser Spaltung führt, von Zellen und nicht vom Coronavirus. Die oben genannten Merkmale entsprechen den allgemeinen Kriterien für die RNA-Spaltung durch zelluläre RNase L unter den bekannten zellulären RNasen. Daher wird vermutet, dass die Spaltungsmerkmale mit den Eigenschaften der zellulären Endoribonuklease RNase L korrelieren. RNase L ist ein latentes Enzym, das in nahezu jeder Säugetierzelle konstitutiv exprimiert wird [31]. Das RNase L-Monomer ist inaktiviert; Daher repräsentieren die Expressionsniveaus von RNase L möglicherweise nicht ihre Funktion bei der RNA-Spaltung [32]. Weil (i) die 2'-5'-Oligoadenylat-Synthetase (OAS) ATP zur Synthese von 2',5'-verknüpften Oligoadenylaten (2–5 A) verwenden kann und (ii) das synthetisierte 2–5 A der einzige Faktor ist, der dies kann bewirken, dass inaktive RNase-L-Monomere aktivierte RNase-L-Dimere bilden, was zur Spaltung von RNA, einschließlich rRNA, führt. Der Grad der OAS-Genexpression ist ein Indikator für den Grad der aktivierten RNase-L, und die rRNA-Spaltung liefert funktionelle Beweise für die Aktivierung von RNase L [33,34,35,36]. Um die Korrelation der DVG12.7-Spaltung mit RNase L zu untersuchen, wurde DVG12.7 in HRT-18-Zellen und A549-Zellen transfiziert. Bei 0,1, 1,5 und 3 hpt wurde die gesamte zelluläre RNA gesammelt und (i) einer Elektrophorese auf einem Formaldehyd-Agarose-Gel unterzogen, um die Spaltung von rRNA nachzuweisen, (ii) RT-qPCR, um die Konzentrationen von OAS-mRNA zu quantifizieren, und (iii) ein Northern-Blot-Assay zum Nachweis der Synthese von clvDVG. In DVG12.7-transfizierten HRT-18-Zellen wurde (i) keine rRNA-Spaltung beobachtet (Abb. 4A, linkes Feld), (ii) Grundmengen an OAS-mRNA nachgewiesen (Abbildungen S1A und S1C) und (iii) die Die OAS-mRNA-Spiegel stiegen mit der Zeit nicht an (Abb. 4A, rechtes Feld und Abbildung S1A). In A549-Zellen begann jedoch (i) die rRNA-Spaltung bei 1,5 hpt und wurde bei 3 hpt sichtbar (Abb. 4B, linkes Feld), (ii) wurden Grundmengen an OAS-mRNA nachgewiesen (Abbildungen S1B und S1C) und (iii ) Die Konzentrationen der OAS-mRNA stiegen mit der Zeit an (Abb. 4B, rechtes Feld und Abbildung S1B). Andererseits ergab der Northern-Blot-Assay in HRT-18-Zellen, dass DVG12.7 gespalten wurde, das Verhältnis von gespaltenem zu ungespaltenem DVG12.7 jedoch nahezu unverändert blieb (Abb. 4C). Im Gegensatz dazu deuteten die Testergebnisse bei A549-Zellen darauf hin, dass sowohl die Menge an gespaltenem DVG12.7 als auch das Verhältnis von gespaltenem zu ungespaltenem DVG12.7 mit der Zeit zunahmen (Abb. 4D). Darüber hinaus war das Spaltungsmuster von DVG12.7 dem des durch RNase L gespaltenen Hepatitis-C-Virus-Genoms sehr ähnlich [18, 35].

Da in A549-Zellen die Konzentrationen von OAS-mRNA (Abb. 4B, rechtes Feld), gespaltener rRNA (Abb. 4B, linkes Feld) und gespaltenem DVG12.7 (Abb. 4D) mit der Zeit zunahmen, wurde die Spaltung von DVG12.7 in A549-Zellen korrelierten möglicherweise mit der Aktivierung von RNase L. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse (Abb. 4B und D) wurde die Spaltung von DVG12.7 in HRT-18-Zellen wie folgt bewertet. Weil (i) vermutet wurde, dass Zellen Grundmengen an OAS enthalten, die RNase L unabhängig von IFN aktivieren können [37, 38](ii) HRT-18-Zellen enthielten auch Grundmengen an OAS-mRNA (Abbildungen S1A und S1C) und (iii) die Mengen an OAS-mRNA (Abb. 4A, rechtes Feld) und gespaltenem DVG12.7 (Abb. 4C) taten dies nicht Während die rRNA mit der Zeit zunimmt und die rRNA nicht gespalten wurde (Abb. 4A, linkes Feld), wird spekuliert, dass DVG12.7 nach der Transfektion durch RNase L gespalten werden kann, die durch die Grundwerte von OAS aktiviert wird. Da jedoch die Konzentrationen von OAS und damit der aktivierten RNase L mit der Zeit nicht anstiegen, reichen die Grundkonzentrationen der aktivierten RNase L nicht aus, um rRNA zu spalten. Folglich könnte dieser Befund erklären, warum DVG12.7 unmittelbar nach der Transfektion gespalten werden kann und warum das Verhältnis von gespaltenem zu ungespaltenem DVG12.7 in HRT-18-Zellen nahezu unverändert ist (Abb. 2 und 4C). Angesichts dieser Ergebnisse wird vermutet, dass die erhöhte Genexpression von OAS und die anschließende Aktivierung von RNase L in A549-Zellen über den IFN-Signalweg über die 5'-Triphosphatgruppe und die von DVG12.7 gebildete doppelsträngige RNA erfolgen, wie durch gezeigt die Zunahme der rRNA-Spaltung im Laufe der Zeit (Abb. 4B, linkes Feld), was zu einem erhöhten Niveau der DVG12.7-Spaltung führt (Abb. 4D). Weil (i) das Spaltungsmuster von DVG12.7 in A549-Zellen mit den aktivierten RNase-L-Spiegeln korrelierte und (ii) die Spaltungsmuster von DVG12.7 in HRT-18-Zellen und A549-Zellen ähnlich sind, obwohl die Menge an gespaltenem DVG12. 7 in A549-Zellen mit der Zeit zunimmt, deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Spaltung von DVG12.7 in HRT-18-Zellen mit einer zellulären Endoribonuklease mit den Eigenschaften von RNase L korreliert sein könnte.